Emissione di fluorescenza potenziata dal cristallo fotonico e soppressione del lampeggio per il biosensing con risoluzione digitale a punto quantico singolo

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4647 (2022) Citare questo articolo

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Sebbene gli emettitori quantistici su scala nanometrica siano tag efficaci per misurare le interazioni biomolecolari, la loro utilità per applicazioni che richiedono osservazioni di singole unità sono limitate dai requisiti per obiettivi ad ampia apertura numerica (NA), intermittenza della fluorescenza e scarsa efficienza di raccolta di fotoni derivante dall'emissione omnidirezionale. Qui riportiamo un miglioramento del segnale di quasi 3000 volte ottenuto attraverso effetti moltiplicativi di eccitazione potenziata, estrazione altamente direzionale, miglioramento dell'efficienza quantistica e soppressione del lampeggiamento attraverso una superficie di cristallo fotonico (PC). L'approccio raggiunge la sensibilità del singolo punto quantico (QD) con un elevato rapporto segnale-rumore, anche quando si utilizza una lente a basso NA e una configurazione ottica economica. La capacità di soppressione del lampeggio del PC migliora il tempo di attivazione dei QD dal 15% all'85%, migliorando l'intermittenza del segnale. Abbiamo sviluppato un test per biomarcatori miRNA associati al cancro con risoluzione di singola molecola, selettività di mutazione a base singola e limite di rilevamento di 10 attomolari. Inoltre, abbiamo osservato traiettorie differenziali di movimento superficiale dei QD quando la loro rigidità di attacco superficiale viene alterata modificando una singola base in una sequenza di miRNA specifica per il cancro.

I reporter fluorescenti chimici e basati su nanoparticelle sono componenti ampiamente utilizzati nella ricerca sulle scienze della vita e nella diagnostica molecolare. I tag generatori di fotoni consentono la visualizzazione e la quantificazione degli analiti biologici collegando il reporter a una molecola bersaglio, seguita dal rilevamento con uno strumento che eccita la fluorescenza mentre raccoglie l'emissione di fotoni in un sensore ottico. I QD colloidali offrono un'ampia gamma di proprietà ottiche utili per i test digitali con letture di singole molecole, inclusi grandi coefficienti di assorbimento (>107 M–1 cm–1), bande di emissione strette e ampiamente sintonizzabili, elevata fotostabilità ed elevata efficienza quantica. Il miglioramento dei reporter fluorescenti attraverso intensità di campo elettromagnetico potenziate localmente da superfici plasmoniche e nanostrutture si è dimostrato una strategia efficace per ottenere limiti di rilevamento ridotti nei test biomolecolari1,2,3,4,5,6, in particolare per i test che rilevano aggregati di molti fluorofori , la cui emissione è combinata per produrre segnali rilevabili al di sopra della fluorescenza di fondo e del rumore di ripresa dei fotorilevatori7,8,9,10. Le strategie di analisi comuni includono l'aggregazione di molti fluorofori insieme (ad esempio, uno spot di microarray) o l'utilizzo dell'amplificazione enzimatica per generare grandi quantità di reporter fluorescenti da un singolo analita.

Negli ultimi anni, molte ricerche hanno affrontato il problema di migliorare l’eccitazione di singoli reporter fluorescenti, raccogliendo in modo efficiente la loro emissione di fotoni e generando segnali che consentano loro di essere osservati in presenza di una varietà di sorgenti di rumore. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), ad esempio, può ottenere la risoluzione di un singolo fluoroforo utilizzando costosi obiettivi a immersione in olio ad alto NA e telecamere accoppiate a carica con moltiplicazione di elettroni (EM-CCD) per fornire un aumento di oltre 30 volte del segnale-a. -rumore11, 12. Le nanostrutture plasmoniche13,14,15,16,17,18 si sono dimostrate efficaci per l'aumento localizzato dell'intensità di eccitazione del campo elettrico con un fattore di aumento della fluorescenza da ~100 a ~1000, sebbene molte strutture plasmoniche soffrano di un elevato rapporto non-rumore decadimento radiativo dovuto a perdite intrinseche nel metallo, tempra e bassa direzionalità dei fotoni emessi16. Inoltre, la lunghezza d'onda di risonanza di tali nanostrutture è fissata dalla dimensione, dalla forma e dal materiale dei nanorisonatori. I primi approcci per entusiasmare i reporter fluorescenti con microcavità ottiche dielettriche dimostrano modesti miglioramenti del tasso di emissione19,20,21. Una limitazione delle microcavità dielettriche è la mancata corrispondenza tra le risonanze ad alto Q della cavità e l'emissione spettralmente ampia da emettitori fluorescenti allargati in modo disomogeneo a temperatura ambiente. Recenti rapporti sull'aumento del campo elettromagnetico con nano-gap ibrido plasmonico-dielettrico e lastre di nanofili dielettrici22 hanno affrontato questi problemi e mostrano un miglioramento di circa 1000 volte, ma con un piccolo numero di punti caldi altamente localizzati che occupano scarsamente solo una piccola frazione della superficie totale la zona. Tuttavia, per ottenere fattori di potenziamento così elevati attraverso una sofisticata nanofabbricazione è necessario un allineamento preciso tra gli emettitori di fluorescenza e le modalità della cavità. Per superare questi problemi, la nostra ricerca precedente ha utilizzato un approccio basato sulla microscopia per l’aumento della fluorescenza da una superficie del PC su aree superficiali estese. È stato riportato un aumento di 60 volte dell'intensità della fluorescenza da uno strato di streptavidina coniugata con Cy-5 su un PC23 unidimensionale. Questo miglioramento può essere migliorato fino a 360 volte accoppiando la modalità leaky del PC a una cavità sottostante di tipo Fabry-Perot attraverso un riflettore a specchio dorato24. È stato segnalato un miglioramento della fluorescenza di 108 × per uno strato di QD utilizzando l'estrazione della fluorescenza assistita in modalità leaky da una superficie bidimensionale del PC25. Più recentemente, Yan et al. hanno dimostrato un PC a eterostruttura multipla con una banda di arresto super ampia per ottenere un miglioramento della fluorescenza a banda larga di oltre 100 volte26, che ha richiesto una complicata fabbricazione strato per strato di monostrati di cristallo colloidale 2D autoassemblati. Sono state utilizzate anche strutture tridimensionali di PC per migliorare la fluorescenza. Canzone et al. rivestito con spin-coating uno strato di colorante Ru su PC opalini 3D composti da multistrati di sfere di PMMA per ottenere un miglioramento della luminescenza di circa 320 volte con configurazioni a doppia banda di arresto27.